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荧光定量PCR简介

欣赏次数: 日期:2019年4月10日 07:41
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择要:

  荧光定量PCR检测技能降生至今已10多年的工夫,而其使用不停都没普遍睁开,究其缘故原由,无外乎受制于相干仪器、试剂和技能的开展。近期,尤其是08年以来,仪器和试剂是各处着花,这也使科研职员均摩拳擦掌[mó quán cā zhǎng],都想借此技能使本人的研讨能日新月异[rì xīn yuè yì],开展势头经过查找每年所宣布的文章数可一览无余[yī lǎn wú yú]。占有关统计,在 Medline 数据库中,用“Taqman” 或 ”real time PCR” 作为要害词检索,1996 年是19 篇,1999 年157 篇,到2003 年就高达2984 篇,2009年会是几多呢?ag客户端不得而知。但其迅猛的开展势头倒是不行变动的,ag客户端朴拙盼望能和浩繁研讨职员通力合作[tōng lì hé zuò],捉住这一大好机遇,为科研奇迹的开展奉献本身的力气。基于这一目的,ag客户端临时以来对荧光定量PCR,无论是技能照旧多年来的产品,均举行了深化地研讨,并实时推出愈加优秀的荧光定量 PCR技能办事。

荧光定量PCR原理

  荧光定量PCR最早称TaqMan PCR,厥后也叫Real-Time PCR,是美国PE(Perkin Elmer)公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技能。该技能是在惯例PCR底子上参加荧光标志探针或响应的荧光染料来完成其定量功效的。其原理:随着PCR反响的举行,PCR反响产品不停累计,荧光信号强度也等比例增长。每颠末一个循环,搜集一个荧光强度信号,如许ag客户端就可以经过荧光强度变革监测产品量的变革,从而失掉一条荧光扩增曲线图。

  一样平常而言,荧光扩增曲线可以分红三个阶段:荧光配景信号阶段,荧光信号指数扩增阶段宁静台期。在荧光配景信号阶段,扩增的荧光信号被荧光配景信号所掩饰笼罩,无法判别产品量的变革。而在平台期,扩减产物已不再呈指数级的增长,PCR 的终产品量与肇始模板量之间没有线性干系,依据终极的 PCR 产品量也不克不及盘算出肇始 DNA 拷贝数。只要在荧光信号指数扩增阶段, PCR产品量的对数值与肇始模板量之间存在线性干系,ag客户端可以选择在这个阶段举行定量剖析。为了定量和比力的利便,在及时荧光定量 PCR 技能中引入了两个十分紧张的观点:荧光阈值和 CT值(如下图所示)。

荧光域值(threshold)

  是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值,它可以设定在荧光信号指数扩增阶段恣意地位上,但一样平常荧光域值的缺省设置是PCR反响前3-15个循环荧光信号尺度偏向的10倍,即:threshold。

 

Ct值与肇始模板的干系:

  研讨标明,每个模板的Ct值与该模板的肇始拷贝数的对数存在线性干系,肇始拷贝数越多,Ct值越小。使用已知肇始拷贝数的尺度品可作出尺度曲线,此中横坐标代表肇始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct值如下图所示。因而,只需取得未知样品的Ct值,即可从尺度曲线上盘算出该样品的肇始拷贝数。

 

荧光定量检测

  荧光定量检测依据所利用的标志物差别可分为荧光探针和荧光染料。荧光探针又包罗Beacon技能(分子信标技能,以美国人Tagyi为代表)、 TaqMan探针(以美国ABI公司为代表)和FRET技能(以罗氏公司为代表)等;荧光染料包罗饱和荧光染料和非饱和荧光染料,非饱和荧光染料的典范代表便是如今最常用的SYBR GreenⅠ;饱和荧光染料有EvaGreen、LC Green等。

嵌合荧光染料法(SYBR GreenⅠ)

  SYBR Green I是荧光定量PCR最常用的DNA联合染料,与双链DNA非特异性联合。在游离形态下,SYBR Green I收回薄弱的荧光,但一旦与双链DNA联合,其荧光增长1000倍。以是,一个反响收回的所有荧光信号与出线的双链DNA量呈比列,且会随扩减产物的增长而增长。

 

SYBR Green I荧光染料与DNA双链的联合

  双链DNA联合染料的好处:实行设计复杂,仅必要2个引物,不必要设计探针,无需设计多个探针即可以疾速查验多个基因,且可以举行熔点曲线剖析,查验扩增反响的特异性,低的初始本钱,通用性好,因而国际内在科研中利用比力广泛。

  荧光探针法(Taqman 技能):PCR扩增时,参加一对引物的同时再参加一个特异性的荧光探针。该探针为不停线型的寡核苷酸,两头辨别标志一个荧光陈诉基团和一个荧光淬灭基团,探针完备时,陈诉基团发射的荧光信号被淬灭基团吸取,PCR 仪检测不到荧光信号; PCR扩增时(在延伸阶段),Taq 酶的 5' - 3' 切酶活性将探针酶切降解,使陈诉荧光基团和淬灭荧光基团分散,从而荧光监测体系可吸收到荧光信号,即每扩增一条 DNA 链,就有一个荧光分子构成,完成了荧光信号的累积与 PCR 产品构成完全同步,这也是定量的底子地点。其历程如下图所示

 

荧光定量PCR的使用

分子生物学研讨

  1 核酸定量剖析。对感染性疾病举行定量定性剖析,病原微生物或病毒含量的检测 , 好比近期盛行的甲型H1N1流感, 转基因动动物基因拷贝数的检测,RNAi 基因失活率的检测等。

  2 基因表达差别剖析。比力颠末差别处置样本之间特定基因的表达差别(如药物处置、物理处置、化学处置等) ,特定基因在差别时相的表达差别以及cDNA芯片或差显后果确实证

  3 SNP 检测。检测单核苷酸多态性关于研讨个别对差别疾病的易理性大概个别对特定药物的差别反响有偏重要的意义,因分子信标布局的奇妙性,一旦SNP 的序列信息是已知的,接纳这种技能举行高通量的 SNP 检测将会变得复杂而正确。

  4 甲基化检测。甲基化同人类的很多疾病有关,分外是癌症, Laird 报道了一种称作 Methylight的技能,在扩增之前先处置 DNA ,使得未甲基化的胞嘧啶酿成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶不受影响,用特异性的引物和 Taqman探针来区分甲基化和非甲基化的 DNA ,这种办法不但利便并且敏捷度更高。

医学研讨

  5 产前诊断:人们对遗传性物质改动惹起的遗传性疾病还无法医治,到现在为止,还只能只能经过产前监测,增加病婴出生,以避免各种遗传性疾病的产生,如为增加X连锁遗传病患儿的出生,从孕妇的外周血中分散胎儿DNA,用及时荧光定量PCR检测其Y性别决议区基因是一种无创伤性的办法,易为孕妇所承受。

  6 病原体检测:接纳荧光定量PCR检测技能可以对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、结核分枝杆菌、EB病毒和大小胞病毒等病原体举行定量测定。与传统的检测办法相比具有敏捷度高、取样少、疾速轻便等好处。

  7 药物疗效稽核:对乙型肝炎病毒 (HBV)、丙型肝炎病毒 (HCV) 定量剖析表现:病毒量与某些药物的疗效干系。HCV高程度表达,搅扰素医治作用不敏感,而HCV低滴度,搅扰素作用敏感;在拉米夫定医治历程中,HBV- DNA的血清含量曾有降落,随后若再度上升或凌驾曩昔程度,则提醒病毒产生变异。

  8 肿瘤基因检测:只管肿瘤发病的机理尚未明白,但相干基因产生渐变是致癌性变化的基本缘故原由已被普遍承受。癌基因的表达增长和渐变,在很多肿瘤晚期就可以呈现。及时荧光定量 PCR不光能无效地检测到基因的渐变,并且可以正确检测癌基因的表达量。现在用此办法举行过端粒酶hTERT基因、慢性粒细胞性白血病WT1基因、肿瘤 ER基因、前线腺癌PSM基因、肿瘤相干的病毒基因等多种基因的表达检测。丁香园

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